Anticuerpos monoclonales

Dr. Franklin Aldecoa Bedoya(*)

Estructura y producción de los Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos están compuestos por cadenas de proteínas, con una conformación especial en forma de Y, en la cual se pueden identificar dos cadenas pesadas idénticas (H) y dos cadenas ligeras idénticas (L) unidas por enlaces disulfuro intra e intercatenarias. Cada cadena tiene dominios estructurales, los cuales son formaciones globulares derivadas de la conformación terciaria proteica a esos niveles: dos en las cadenas ligeras (uno constante CL, y otro variable VL); las cadenas pesadas contienen un dominio variable (VH) y 3 ó 4 dominios constantes (CH), dependiendo del isotipo del anticuerpo. La Ig.G está compuesta por 3 dominios constantes con la región bisagra (porción más flexible de toda la estructura) ubicada entre CH1 y CH2, lugar donde la papaína actúa escindiendo la molécula en tres partes: dos porciones Fab (Fragment antigen-binding) en relación al reconocimiento antigénico y una porción Fc (Fragment crystalline) en relación a ligazón receptores de la superficie celular y a la fijación del complemento. La especificidad y afinidad del receptor del antígeno en la región aminoterminal está determinada por 6 áreas hipervariables (3 de la cadena H y 3 de la L), las cuales son llamadas determinantes antigénicos o regiones determinantes de complementariedad (1-4) (Figura 1). La diversidad (repertorio de anticuerpos) se produce en el ámbito genético por recombinación somática a partir de una misma línea germinal, postulado probado por Susumo Tonegawa por cuyo trabajo obtuvo el Premio Nobel en 1987 (5).

FIGURA 1

Estructura de las inmunoglobulinas. El diagrama corresponde a la inmunoglobulina G: Tiene 3 dominios constantes en la cadena pesada y la región bisagra entre C1 y C2.

La mayoría de Anticuerpos Monoclonales (AMC) son de origen murino y son producidos por una combinación híbrida derivada de la fusión de una línea celular de mieloma inmortal, con una célula B productora de un anticuerpo específico conocido, a partir de un ratón inmunizado con células enteras, extractos celulares o antígenos purificados. Las técnicas utilizadas para poder fusionar ambas células incluyen el uso del virus Sendai (originalmente usado por Köhler y Milstein en 1975 en el origen del hibridoma, lo cual les permitió ganar el Premio Nobel en 1984) (6), el uso del polietilenglicol y de corriente eléctrica. Debido a que la fusión es un evento relativamente raro cuando se usan las dos primeras técnicas, una estrategia de selección es usada para asegurar el crecimiento de las células fusionadas o hibridoma e inhibir el crecimiento de las células de mieloma que no lograron unirse al correspondiente linfocito B. Basados en estos hechos, se usa una línea celular de mieloma con deficiencia en la formación de la enzima Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa o la Timidina quinasa, importantes en las vías metabólicas de rescate en la biosíntesis de purinas y pirimidinas. Por tanto, al usar un bloqueador de las vías de síntesis de nucleótidos -como la aminopterina- para formar ácidos nucleicos, las células de mieloma que no se fusionen morirán al no tener la posibilidad de usar vías alternativas de síntesis de nucleótidos, sin embargo, las células de mieloma que se fusionen con las correspondientes células B, tendrán dicho camino metabólico indemne, pues los linfocitos B poseen dicha información que permitirá vivir al hibridoma. De esta forma se aprovecha la inmortalidad de las células de mieloma, que además genera inmunoglobulinas desconocidas, con la generación de anticuerpos específicos y conocidos derivados de la célula B, que no pueden mantenerse o inmortalizarse en el laboratorio (Figura 2). Finalmente los AMC pueden elaborarse inyectando los hibridomas a nivel de la cavidad peritoneal del ratón y recolectándolos posteriormente en el líquido ascítico correspondiente, o producirlo a grandes escalas in vitro, usando diversas técnicas laboratoriales (1, 7).

FIGURA 2

Producción de los hibridomas para la generación de anticuerpos monoclonales. (Modificado de Abbas AK')

Anticuerpos monoclonales e Ingeniería Genética

La estructura molecular de los AMC puede ser mejorada cambiando, reemplazando o eliminando algunos fragmentos (Ver Tabla 1), lo cual posibilita propiedades terapéuticas más adecuadas que incluyen:

1. Reducir la respuesta humana anti-murina, con la generación de AMC quiméricos o humanizados.
2. Realzar las funciones efectoras de la fracción Fc.
3. Alterar la farmacocinética del aclaramiento plasmático y a nivel corporal total.
4. Incrementar la penetración del AMC dentro del tejido al cual se dirige.
5. Incrementar la afinidad por ciertos tejidos.
6. Desarrollar inmunoglobulinas conjugadas con drogas, toxinas, modificadores de la respuesta biológica, isótopos, etc. que cumplan funciones terapéuticas específicas.

Una de las variaciones importantes en la estructura de los anticuerpos fue el cambio de las regiones constantes de los AMC de murino a humano, lo cual contribuyó a una menor inmunogenicidad y a una mejor actividad efectora de la región Fc (Anticuerpos quiméricos). Un avance mayor se logró cuando se reemplazó toda la molécula del anticuerpo con una Ig humana a excepción de los determinantes antigénicos (Anticuerpos humanizados) (7-11) (Figura 3).

FIGURA 3

Evolución de los anticuerpos monoclonales: Fragmentos obtenidos por Ingeniería Genética.

Recientemente, una alternativa a la producción de AMC por las vías clásicas ha sido el uso de técnicas genéticas moleculares para clonar y expresar genes de anticuerpos, eliminando la fusión celular. Las regiones variables de las inmunoglobulinas son amplificadas a partir de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para luego ser clonadas dentro de un vector apropiado. El fragmento de anticuerpo resultante puede ser producto secretante de una bacteria o ser expresado en la superficie de la misma o de un fago (12).

Principales usos médicos de los Anticuerpos monoclonales

El primer y lógico uso de los AMC ha tenido lugar en el diagnóstico, siendo actualmente usadas rutinariamente en muchos kits laboratoriales disponibles comercialmente. Posteriormente y de manera paulatina se ha ingresado al dominio terapéutico sobre todo en las áreas infecciosa, oncológica y de las enfermedades autoinmunes, con resultados cada vez más promisorios que permiten visualizar un arsenal terapéutico importante a futuro.

1.Anticuerpos Monoclonales en las enfermedades infecciosas

La terapia basada en anticuerpos fue inicialmente usada en la década de los 90 del siglo XIX, sin embargo, la frecuente ocurrencia de efectos colaterales en pacientes que recibían sueros inmunes heterólogos y el alto grado de variabilidad entre los diferentes sueros preparados significó un rápido abandono de la "terapia sérica", ante el advenimiento de la quimioterapia antimicrobiana en la década de los 30 del siglo posterior (13). Obviamente los intentos tempranos de tratamiento de las enfermedades infecciosas con anticuerpos, no explotaron las ventajas de la especificidad ofrecidas por los AMC, ni los avances biotecnológicos que están logrando las compañías generadoras de anticuerpos puros en una producción de escala. En el momento actual, la terapia de las infecciones con AMC está tomando cada vez mayor interés por diferentes razones como el desarrollo de resistencia progresiva, la búsqueda de antimicrobianos cada vez más específicos contra ciertos patógenos, aunque esto signifique desventaja cuando la infección sea polimicrobiana o causada por varios serotipos de un mismo microorganismo. La flexibilidad de la estructura de los anticuerpos ofrece también más de una línea de ataque en la terapia antimicrobiana.

Las inmunoglobulinas pueden ser dirigidas directamente contra los microorganismos inhibiendo la posibilidad de adhesión entre las células y el patógeno, estimulando la aglutinación microbiana, pero además pueden usarse para neutralizar las toxinas bacterianas o para estimular la acción de otros efectores celulares. El gran potencial de los AMC radica en la prevención más que en el tratamiento, sobre todo desde el punto de vista de salud pública. Una particular forma de prevenir las infecciones es no permitir la entrada del patógeno dentro del organismo, por tanto, la aplicación de anticuerpos monoclonales a la superficie de las mucosas, con el bloqueo consiguiente de la adhesión de los microorganismos a sus células blanco sería una buena alternativa. La mayoría de infecciones se inician en la superficie de las mucosas (más de 400 m2 en un humano adulto) a partir de la colonización y adhesión de las bacterias o virus a receptores expresados por las células (la adhesión bacteriana está mediada por adhesinas). La llegada de los AMC específicos a través de diversas medios como gel, solución, aerosol o su liberación a través de polímeros, hacía el moco que cubre las mucosas permite la posible interacción con el patógeno que podría causar enfermedad.

El isotipo más predominante y apropiado normalmente para proteger las mucosas es la Inmunoglobulina de Superficie A (SIg.A) el cual es un dímero tetravalente especialmente estable y adaptado al ambiente enzimático hostil que generalmente se encuentra en las superficies mucosas. Los anticuerpos resultan ser como antimicrobianos de amplio espectro que pueden ser dirigidos contra patógenos de cualquier clase, sin embargo, cada AMC es específico de sólo un epítope bacteriano lo cual le da la ventaja teórica de no generar resistencia entre los microorganismos no relacionados al blanco bacteriano elegido y no producir por tanto, grandes disturbios en la flora bacteriana normal. La acción de los AMC no estaría solamente limitada a patógenos extracelulares; aunque usualmente se piensa que los patógenos intracelulares están fuera del alcance de los anticuerpos, existen varios reportes sobre la actividad de las inmunoglobulinas sobre algunos de estos microorganismos: algunos AMC Ig.A pueden neutralizar virus intracelulares, también se ha reportado interferencia de la replicación del Toxoplasma gondii por AMC, se ha comunicado asímismo, el ingreso de la Ig.G anti-DNA a nivel citoplasmático y nuclear de células vivas. Los anticuerpos pueden actuar de diversas maneras sobre su blanco: inhibición de la adhesión microbiana, aglutinación, neutralización viral, neutralización de toxinas, citotoxicidad celular mediada por anticuerpos, activación del complemento y opsonización (14-16). En la Tabla 2 se muestra la inmunización pasiva tópica específica a nivel de mucosa, con una alta efectividad preventiva sobre algunos patógenos.

2.Anticuerpos Monoclonales en inmunología

2.1. Artritis Reumatoide (AR)

Es conocido que algunas condiciones médicas que incluyen la artritis reumatoide y la diabetes mellitus entre otros, son el resultado de desequilibrios en los mecanismos inmunes de la propia tolerancia. Aunque las causas de la artritis reumatoide permanecen desconocidas, los avances en la biología molecular han facilitado la identificación de los grupos de células y citoquinas que contribuyen a la inflamación y a realzar el componente destructivo de la enfermedad. Los AMC han mostrado algunas promesas en la restauración del equilibrio inmunológico con el uso de anticuerpos contra citoquinas proinflamatorias como el Factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), interleuquina 1(IL-1) ó contrarrestando la actividad de linfocitos comprometidos con la inflamación de la artritis reumatoide. Estudios clínicos de fase II y III con AMC anti-TNF (infliximab y etanercept) han demostrado un aceptable perfil de seguridad y marcada eficacia clínica en casos de AR que no responden adecuadamente a la terapia convencional. La combinación de estos AMC con el metotrexate parece ser de particular efectividad en aquellos pacientes refractarios a los tratamientos convencionales incluyendo monoterapia con metotrexate. Los antagonistas de los receptores anti-IL-1 muestran una actividad antiinflamatoria modesta con relación a los primeros, con un posible retardo del daño articular. Tanto etanercept como infliximab han sido aprobados por la FDA como agentes efectivos para la AR. Nuevas estrategias tomando en consideración otras citoquinas proinflamatorias serán desarrolladas a futuro tomando en cuenta la gran red de acción que tienen con relación a la respuesta inflamatoria (35).

2.2. Trasplante de órganos

Uno de los usos más interesantes y exitosos de los AMC ha sido llevado a cabo en los trasplantes de órganos. El rechazo de los injertos trasplantados está asociado con la respuesta inmune específica del receptor hacia los antígenos del donante, respuesta mediada por linfocitos T y B. Los linfocitos T son los elementos centrales de respuesta y una vez activados por el antígeno inducen el reclutamiento, diferenciación y activación de otras células inmunes. La activación de los linfocitos T requiere dos señales las cuales requieren una primera interacción entre el Receptor de las Células T (RCT) y el Antígeno de Histocompatibilidad Mayor (AHM) asociado al antígeno, los cuales son expuestos por las Células Presentadoras de Antígenos (CPA); la segunda interacción está dada por transducción celular a partir del complejo CD3 asociada al primer fenómeno, pero además, existen moléculas accesorias, coestimulatorias y adhesivas sin cuya presencia no podría llevarse a cabo la activación linfocitaria (36) (Figura 4).

La activación del linfocito T incluye la inducción de IL-2 y la expresión de receptores de alta afinidad de IL-2 (IL-2R). La IL-2 se une a su receptor específico de alta afinidad en los linfocitos T activados, los cuales estimulan la proliferación y diferenciación de linfocitos T ayudadores o citotóxicos, linfocitos B, células asesinas o natural killer y macrófagos, la generación de interleuquinas por parte de estas células, median funciones efectoras que resultan en daño tisular asociado a rechazo del injerto. Los receptores de alta afinidad IL-2R que se encuentran en los linfocitos activados están compuestos por 3 subunidades: IL-2Ra ó CD-25 (también conocida como Antígeno de Activación Celular T (TAC), IL-2Rb e IL-2Rg. La mayoría de linfocitos T y B inactivos y las natural killer expresan un receptor de afinidad intermedia conformado con los dos últimos componentes, pues IL-2Ra ó CD-25 solamente es expresado por linfocitos activados por antígenos extraños (36,37). Desde los inicios de 1980 fueron desarrollados una serie de AMC diseñados para actuar en diferentes puntos de la activación del linfocito T, la mayoría de ellos dirigidos contra receptores de superficie tales como el complejo RCT/CD3, receptores de citoquinas como la anti IL-2R o contra moléculas de adhesión. El OKT3 fue el primer AMC introducido dentro de la práctica clínica (Muromonab-CD3), el cual reconoce específicamente la cadena e del complejo CD3 en trasplante, habiendo demostrado ser efectivo en el retraso del rechazo en el periodo post-trasplante inmediato o temprano e incluso revirtió algunos episodios de rechazo agudo. Sin embargo el costo y los efectos colaterales asociados al medicamento restringieron su uso, siendo actualmente considerado como un tratamiento de rescate para pacientes con rechazo agudo resistentes a esteroides. OKT3 fue altamente efectivo en prevenir el rechazo en el período post trasplante inmediato y evitó la nefrotoxicidad y hepatotoxicidad vistos en pacientes tratados tempranamente con ciclosporina. Desafortunadamente la inmunosupresión no selectiva del muromonab-CD3 permitió una alta incidencia de infecciones oportunistas y linfomas(38-41). Posteriormente se crearon una serie de AMC dirigidos contra el RCT, pero demostraron a través de la experimentación clínica que producían menor inmunosupresión que el OKT3 por lo cual fueron rápidamente dejados de lado para explorar otros blancos inmunológicos. En los últimos años se ha experimentado con los AMC anti CD4 en trasplantes y enfermedades autoinmunes, sin embargo, solo recientemente han comenzado su exploración clínica, por lo que se espera en los próximos años resultados en ambos campos (39).

FIGURA 4

Moléculas comprometidas con el reconocimiento del antígeno, en la inmunidad celular.

En años recientes varios AMC contra los receptores de alta afinidad de la IL-2 han sido desarrollados. Ellos son específicos para diferentes epítopes presentes en la cadena a (CD-25, TAC), pero, aunque estudios experimentales en animales han demostrado que algunos de estos anticuerpos anti IL-2R fueron efectivos, los resultados en humanos han sido variables y en algunos casos desafortunados. Uno de los problemas más frecuentes con los anticuerpos monoclonales murinos es que son antigénicos y forman anticuerpos usualmente dentro del primer mes de tratamiento neutralizando el efecto inicial e incrementando la posibilidad de reacciones alérgicas; otro problema es que los AMC murinos tienen una vida media plasmática corta en el ser humano. Para mejorar los problemas asociados a los AMC murinos, especialmente la inmunogenicidad, se diseñaron por ingeniería genética los AMC quiméricos y humanizados (basiliximab y daclizumab respectivamente),los cuales en conjunción con doble o triple terapia inmunosupresora (ciclosporina, corticoides y otro como azatriopina, micofenolato mofetil) reducen la incidencia de rechazo agudo del injerto, sin aumentar la incidencia de infecciones o neoplasias y con adecuada tolerabilidad y seguridad (42-45).

3.Anticuerpos Monoclonales en cáncer

Los AMC pueden ser usados para reconocer segmentos proteicos específicos sobre la superficie celular de las neoplasias, por tanto ofrecen el potencial enorme de la detección precisa en lesiones recurrentes u ocultas. Los antígenos de la superficie celular pueden ser específicos del tumor o ser expresados en mayor volumen en los tumores que en las células normalmente diferenciadas. Los AMC pueden ser usados solos o conjugados a drogas citotóxicas, citoquinas o radioisótopos los cuales actuarían selectivamente en el blanco correspondiente. Algunos problemas derivados del uso de inmunoconjugados en la terapia del cáncer esperan aún ser resueltos, entre estos, asegurar la estabilidad entre el conjugado y la inmunoglobulina, una optima liberación del conjugado en el blanco celular, mejorar la penetración de los anticuerpos dentro de los tumores sólidos. A favor debemos decir que los AMC ofrecen una más efectiva localización en las enfermedades microscópicas o metastásicas, mayor afinidad a los antígenos, que otras terapias disponibles (7,46-48).

Rituximab

Es un anticuerpo monoclonal específico para el antígeno CD-20 el cual es expresado en los linfocitos B normales y hasta en un 90% o más de los linfomas non Hodgkin. Este AMC generado a través de la técnica del hibridoma produce citotoxicidad de las células blanco, a través del complemento o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (Figura 5). Es efectivo en pacientes con linfomas indolentes recaidos o refractarios, particularmente sobre los de histología folicular y su indicación ha sido aprobada por la FDA y por la Unión Europea. Estudios preliminares en pacientes con linfomas de grado intermedio o alto, sugieren que rituximab puede ser efectivo después de recaídas y también puede mejorar la eficacia del régimen CHOP en el tratamiento de casos nuevos diagnosticados con linfoma maligno (46, 49-51).

FIGURA 5

Reclutamiento de los mecanismos efectores inmunes del huésped a través del dominio Fc humano en la acción del rituximab.

Trastuzumab

El anticuerpo murino 4D5 ha sido "humanizado" para producir trastuzumab, una inmunoglobulina con secuencias murinas conservadas a nivel de las regiones hipervariables de la fracción Fab, pero el resto de la molécula del anticuerpo es cambiada por técnicas biotecnológicas a componentes humanos. Este AMC se liga fuertemente al dominio extracelular del receptor HER 2. El oncogén HER 2 codifica para un receptor glicoproteico de membrana, que pertenece a la familia de los receptores de los factores de crecimiento, siendo similar al receptor del factor de crecimiento epidermal. En células cancerosas la amplificación del oncogén HER2 resulta en la sobreexpresión celular del receptor correspondiente y el crecimiento tumoral consiguiente. El receptor HER 2 es sobreexpresado en aproximadamente 25 a 30% de tumores cancerosos mamarios y está asociado a pobre pronóstico, de tal forma que las pacientes que lo expresan tienen enfermedad más rápida hacia la progresión y menor probabilidad de sobrevida que aquellas que no sobreexpresan HER 2 (Figura 6). Resultados de estudios de fase III indican que trastuzumab es un efectivo agente antitumoral tanto sólo, como en combinación con agentes antineoplásicos en pacientes previamente tratados, con cáncer de mama metastásico que sobreexpresan el receptor HER 2. Trastuzumab en combinación con terapia antineoplásica retrasa la progresión del cáncer metastásico e induce la retracción tumoral más efectivamente que con terapia antineoplásica sola. En los Estados Unidos, trastuzumab en combinación con paclitaxel ha sido aprobada como primera línea de tratamiento en pacientes con cáncer de mama metastásico HER 2 positivas (46, 52-54).

FIGURA 6

Amplificación del gen HER2, con la consiguiente sobreexposición del receptor desuperficie y l acción de trastuzumab.

Anticuerpos Monoclonales: El futuro

Desde su descubrimiento los AMC han evolucionado a una velocidad vertiginosa, habiéndose logrado mejorar todas sus características y su adaptación para servir tanto en el área diagnóstica como terapéutica. Sin embargo, algunos problemas han surgido en áreas clínicas particulares que están siendo resueltas paulatinamente, lográndose cada vez mejores posibilidades de eficiencia y menor toxicidad asociada. Uno de los problemas más importantes fue la generación de anticuerpos contra las inmunoglobulinas murinas, lo cual ha sido casi eliminado con la creación de los anticuerpos monoclonales humanizados, en los cuales se conserva solamente las regiones hipervariables murinas, mientras el resto de la molécula ha sido reemplazado por componentes humanos. Actualmente, ya se ha comenzado a experimentar la formación de AMC fuera de componentes múridos y a partir de material genético, con lo cual a futuro obtendríamos mayor pureza, afinidad y selectividad. Por tanto, el uso de AMC en el futuro evolucionará acorde a las necesidades del hombre y a su creatividad.

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(* ) Médico Oncólogo Clínico, Profesor Asociado de Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad San Martín de Porres. Grupo Peruano de Estudio de la Biología Molecular en Cáncer.