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Del experimento de la oveja Dolly al cultivo de células embrionarias troncales y totipotentes humanas(*) Introducción Termina la centuria con el develamiento de los códigos del genoma humano lo que significa haber pasado de la descripción e interpretación de la vida y de la enfermedad por sus caracteres fenotípicos: anatomía, fisiología, síntomas y signos clínicos, a la descripción e interpretación genotípica, esto es, basada en las raíces químicas y moleculares del sustrato humano. Y comienza un nuevo milenio con el dominio sobre el proceso de fertilización humana lo que no sólo haría factible la clonación de la especie sino que está permitiendo - por la aplicación de las tecnologías derivadas - el desarrollo, a voluntad, de tejidos con diferenciación específica, que harán posible los transplantes sin los problemas de rechazo que, hasta hoy, los han limitado. ¿A dónde nos va a llevar esta nueva revolución biológica? .... es algo que no podemos avizorar en estos momentos. El control del proceso
de fertilización humana y el manejo en el laboratorio de células
embrionarias totipotentes plantea desafíos y dilemas éticos,
morales, religiosos y políticos que hoy son motivos de debate en
todo el mundo. Biología y reproducción humana Todos los presentes al estudiar la biología aprendimos, tempranamente, (Fig.1), que en los animales superiores el desarrollo de un nuevo ser estaba invariablemente ligado a la unión de la célula sexual femenina, óvulo u ovocito con la célula sexual masculina o espermatozoide, cada uno aportando el 50% del código genético. El resultado de esa unión, el óvulo fertilizado, huevo o cigoto, implantado en el suelo uterino al dividirse sucesivamente constituye las células embrionarias troncales, indiferenciadas y totipotentes que forman primero la mórula o embrión incipiente, luego la blástula, la gástrula y finalmente el feto y el nuevo ser (1-3). Aprendimos, así
mismo, que las células iniciales embrionarias troncales totipotentes
al constituir los tejidos, adquirían calidades distintas en el
proceso que llamamos diferenciación (Fig. 2). Como veremos, de inmediato, estas nociones han cambiado de manera sustancial en los últimos años. Tempranamente, también, reconocimos que el óvulo fertilizado o cigoto por el azar o factores no precisados (Fig. 3), podía dividirse en 2 o más unidades de lo que resultaban dos o más embriones con un idéntico código genético y eran, por lo tanto, clones.
Estas nociones condujeron, hace más de tres décadas, a una serie de experimentos (Fig. 4), primero en animales menores y después en mamíferos, en los que utilizando células troncales totipotentes - separadas de un embrión e implantadas en un útero sustituto - se logró demostrar que era posible la clonación a partir de células embrionarias. Hay que subrayar que estos experimentos fueron muy difíciles y que los éxitos comunicados en la literatura permanecieron casi como curiosidades de laboratorio. Manipular células embrionarias "in utero", fragmentarlas y separarlas, conseguir mantener su viabilidad "in vitro", fusionarlas con óvulos vacíos y luego lograr implantarlas en un útero sustituto, implica procedimientos sumamente delicados y complejos. Son muchísimos los intentos para lograr, casi de suerte, el éxito de una implantación. Ello explica porqué el tema, en cierta forma, durmió por varias décadas (4, 5).
Clonación por transferencia nuclear Un gran avance se hizo, sin embargo, en el año de 1995 en el Instituto Roslin de Edimburgo, Escocia, cuando el doctor Ian Wilmut y colaboradores perfeccionaron la técnica de Clonación por Transferencia Nuclear, usando cultivos de células embrionarias (6, 7). Esta técnica implica el uso de dos células. Ovulo recién
eclosionado(***) y Los investigadores del Instituto Roslin lograron cultivar "in vitro" a las células obtenidas de un embrión y mantenerlas en esos cultivos por tiempos variables. Por experimentación sucesiva lograron demostrar, así mismo, que reduciendo los nutrientes de los medios de cultivo, llevaban a las células embrionarias al estado de reposo o fase GO del ciclo celular. En esta condición las células se mantienen en una fase inactiva y son más susceptibles para ser reprogramadas. En la Fig. 5 ejemplificamos el primer paso de esta tecnología. Partimos de un animal hembra, proveedora del óvulo.
Bajo visión microscópica de gran aumento, el óvulo recién eclosionado es perforado con una micropipeta, especialmente diseñada, que hace la succión del material nuclear; queda así un óvulo vacío (sin material cromosómico). Por otro lado (Fig. 6), de una hembra preñada, proveedora del embrión, se obtienen las células para ser cultivadas "in vitro", con nutrientes reducidos, de las cuales se escogerá la célula en reposo, donante, que con la ayuda de una micropipeta es puesta en contacto con el óvulo vacío (Fig. 7).
Resulta así un óvulo fusionado, "fertilizado", con el material nuclear de la célula donante. La experimentación acumulada demostró a los investigadores del Instituto Roslin que este óvulo requería una estimulación eléctrica (equivalente al ingreso del esperma) para que esta célula inicie su desarrollo. El óvulo así activado es implantado en el útero de otra hembra ("madre sustituta"). Como puede verse el animal resultante va a contener sólo el código genético de la hembra proveedora de la célula embrionaria y por lo tanto será un clon de ésta. Megan y Morag, dos corderos, (Fig. 8) fueron los primeros animales clonados por este procedimiento. En la Fig. 9 ilustramos a la oveja proveedora de la célula donante, a la oveja donante del óvulo vacío y a la madre sustituta con el corderito Megan o Morag recién nacido. Nótese que el corderito es blanco como blanca era la oveja donante de la que fue clonado, mientras que la madre sustituta y la oveja proveedora del óvulo son de otra raza, con "cara negra", con las que no tiene ningún vínculo biológico. El experimento de la oveja Dolly En el mismo Instituto Roslin de Edimburgo, en Febrero de 1997, se origina una noticia que conmocionó al mundo. El Dr. Willmut, en informe aparecido en la revista Nature, comunica haber logrado la clonación de una oveja, la famosa Dolly, a partir de células adultas (8). La técnica seguida fue, esencialmente, la de clonación por transferencia nuclear usando cultivo de células. La diferencia en este caso fue que las células cultivadas eran células adultas. Las figuras siguientes muestran las fases del experimento llevado a cabo por el Dr. Willmut. En primer lugar (Fig.10), vemos la oveja proveedora de la que, con técnicas laparoscópicas, se obtiene un óvulo recién eclosionado, el cual es manipulado bajo microscopía de luz a gran aumento. Con una micropipeta (calibre igual al diámetro de un cabello) se hace la succión del material nuclear, quedando entonces sólo un óvulo vacío.
De otro lado (Fig.11), tenemos la oveja donante de las células adultas, que en este experimento provinieron de la mama. Estas células fueron cultivadas "in vitro", en un medio bajo de nutrientes, para así conseguir que las células al multiplicarse se mantengan en fase GO o de reposo. Después de varios días de cultivo "in vitro", una de estas células es también, por manipulación microscópica, introducida en una micropipeta y luego puesta en contacto con el óvulo vacío (Fig.12). Siguiendo el procedimiento, se aplican estímulos eléctricos que dan lugar al inicio de la división celular. Tenemos entonces, un óvulo fertilizado con material nuclear de la célula donante. Después de seis días, el embrión resultante es implantado en el útero de la madre sustituta. Luego del período gestacional, ésta da a luz a un corderito al que el Dr. Willmut bautizó con el nombre de Dolly.
Las caricaturas ilustradas en la Fig.13 muestran cómo Dolly no tiene nada de la oveja que la parió (madre sustituta), ni de la oveja proveedora del óvulo, ambas ovejas de la raza "cara negra escocesa". En cambio, ella es idéntica, o clon, de la oveja finlandesa Dorset blanca, proveedora del código genético en la célula donante(****).
El asunto implicaba una revolución para la Biología. No se trataba de haber logrado una clonación a partir de células embrionarias, como vimos en el caso de Megan y Morag o de clonaciones a partir de células fetales como se había comunicado en animales menores, sino a partir de una célula adulta, totalmente diferenciada. Algo que hasta entonces había sido insostenible por la biología clásica. Dolly creció normalmente (Fig.14) y en el debido tiempo fue apareada naturalmente. De esa unión nació su hija Bonnie (Fig.15), quedando demostrada la fertilidad y normalidad del clon. Luz verde o luz roja para la clonación humana El tema fue motivo, como ustedes recuerdan, de primeras planas en todo el mundo, porque significaba la posibilidad de hacer réplicas de seres humanos adultos. Los diarios hablaron entonces de fábricas de clones humanos con caracteres voluntariamente seleccionados, de nacimiento de hijos en mujeres vírgenes, de resurrección de muertos, de mujeres que darían nacimiento a sí mismas, etc., etc., y de las consecuencias éticas y biológicas que tales ocurrencias conllevarían (9-11). La polémica alcanzó especial dimensión en los medios científicos y moralistas. Para los primeros, la capacidad de crear un nuevo ser, por un mecanismo distinto al de la fertilización natural no sólo constituía una revolución en la biología, sino que abría enormes posibilidades para el futuro de la medicina, en particular en el campo del reemplazo y transplante de órganos y tejidos. Para los segundos, crear a voluntad una réplica humana o enfrentar la alternativa de cesar una vida para disponer de tejidos u órganos - aunque fuera para corregir defectos o enfermedades - chocaba con principios religiosos y éticos.
¿Es admisible que el hombre manipule la vida humana al margen del creador? ¿Puede justificarse el sacrificio de una vida humana (embrión, feto o recién nacido) para utilizar un órgano o tejido en beneficio del donante del código genético que ha originado la réplica?
El asunto involucró a presidentes, congresistas, líderes de estado, líderes religiosos, a la comunidad científica y al publico en general que expresaba su opinión en encuestas sobre el tema (Fig.16). Incluso asociaciones de pacientes, potencialmente beneficiarios, se sumaron también a una de las orillas de la controversia: ¡Luz verde o luz roja para la clonación humana!. (12, 13). Un solo ejemplo ilustra el tipo de problemática social que podría presentarse con la clonación humana. Supongamos el caso de las mujeres infértiles que deciden clonarse. Obviamente esto no es una cosa utópica porque el problema de infertilidad se da todos los días. Tenemos entonces los casos A (Fig.17), de una mujer infértil (Ha) donante de la célula adulta, utiliza a una hermana (Hb) como proveedora del óvulo y a su madre (M) como receptora o madre sustituta; mostrando la relación del parentesco entre el clon y las participantes. En el caso B (Fig.18), la mujer infértil (Ha), donante de la célula adulta, utiliza a una hermana (Hb) como proveedora del óvulo y a otra hermana (M) como receptora o madre sustituta; la Fig.19 ilustra la relación de parentesco en este caso, y en el caso C (Fig.20), la mujer infértil (Ha), donante de la célula adulta, utiliza a una hermana (Hb) como proveedora del óvulo y a una prima (M) como receptora o madre sustituta; la Fig. 21 ilustra la relación de parentesco en este otro caso. No se requiere mucha imaginación para darse cuenta del caos social, y de las implicancias jurídicas, éticas y legales que podrían originarse con la incorporación definitiva de esta tecnología en la comunidad. Así las cosas, en Enero de 1998, el doctor Richard Reed, físico e investigador, en Chicago, declaró públicamente su decisión de clonar humanos. El Presidente Clinton, luego de convocar a sus consejeros de investigaciones reaccionó de inmediato estableciendo, en los Estados Unidos de América, una moratoria de cinco años para la clonación humana. Esta actitud, con matices varios, se ha adoptado prácticamente en todo el mundo. El tiempo está corriendo, y, por lo tanto, el debate pronto habrá de reabrirse. Embriones humanos
desechados como fuente de investigación
Por otro lado, es una realidad que desde hace varios años, y cada día más, se producen en el laboratorio embriones humanos en las clínicas de fertilidad. Aquellos que no son implantados son destruidos o quedan expeditos para ser donados para investigación. Muchos han hecho reparos morales a esta manipulación experimental de "embriones humanos de laboratorio" porque esos embriones, si son colocados en un útero pueden dar lugar a un ser humano.
En 1994, un panel especial de los Institutos Nacionales de Salud de USA analizó el tema y concluyó que algunos estudios de células derivadas de embriones estaban éticamente justificados. No obstante, una ley del congreso americano estableció que no se autorizaba el uso del dinero federal para investigaciones de embriones humanos. Toda la investigación realizada hasta hoy en este campo ha sido amparada, exclusivamente, por fondos privados. Sin entrar en los detalles de una abundante discusión sobre normas y legislación para investigaciones de este tipo, debemos señalar que en USA, Europa y países desarrollados, el tema no está totalmente resuelto, esperándose, en cualquier momento, una legislación definitiva (14, 15). A comienzo del año pasado, los Institutos Nacionales de Salud de los EEUU anunciaron que financiarán proyectos de investigación de células embrionarias humanas derivados de embriones naturales y de embriones producidos por transferencia de núcleos de células humanas (clones). ¿Por qué se ha producido este cambio?. La respuesta está en desarrollos técnicos que, aparentemente, han superado el problema ético (16, 17). El asunto amerita una breve explicación
Las observaciones y reservas éticas se centran en el hecho de cómo aceptar someter a experimentos a una masa de células (embrión) que tienen la capacidad, al implantarse en el útero, de desarrollar a un ser humano. La Fig. 22 (tomada de Pedersen 17) muestra un embrión humano de cinco días inmediatamente después de la fertilización. Esta es una observación, de todos los días, en las clínicas de fertilidad. El embrión en el estadio de blastocisto (Fig. 23) (modificada de Pedersen,17) es una bolsa hueca cuyo ancho no es mayor que el de una pestaña. Este "blastocisto" tiene una capa de células externas o envoltura y una zona interna engrosada denominada la "masa celular interna". La envoltura es la que, producida la implantación, da lugar a la placenta, fundamental para nutrir al embrión y, por lo tanto, para que pueda constituirse el nuevo ser. La "masa celular interna" es la que forma el feto. La Fig. 24 (tomada de Pedersen,17) ilustra un blastocisto humano abierto para mostrar las dos capas celulares.
Experimentos realizados en animales menores, han demostrado que al colocar el "blastocisto" en un petri o placa de cultivo (Fig. 25) (modificada de Pedersen,17), la envoltura se colapsa y eventualmente desaparece, quedando sólo la "masa de células internas" (Fig. 26) (modificada de Pedersen,17). Esta masa de células de ser implantadas "in útero" ya no puede generar un nuevo ser porque carece de las células que forman la placenta. Se ha comprobado que la "masa de células internas" prolifera en los cultivos por largos periodos (Fig. 27) (modificada de Pedersen,17), manteniendo su condición de células embrionarias precursoras o totipotentes. Son capaces de reaccionar fisiológicamente y pueden dar lugar a todos los tipos de tejidos existentes en un embrión. Cultivo de células embrionarias troncales humanas Con algunas variantes de procedimiento estos mismos experimentos se realizaron en primates y en 1998 James A. Thomson de la Universidad de Wisconsin lo logró con las células derivadas del blastocisto humano. Esto quiere decir que, actualmente, se puede cultivar (manipular o experimentar) una masa de células derivadas de la blástula humana que tiene todos los atributos de las células embrionarias excepto la capacidad de formar placenta (18). La consecuencia de este hallazgo es extraordinaria.
Tener en el laboratorio, por tiempo indefinido, cultivos de "células embrionarias troncales, precursoras o totipotentes humanas" constituye, en este momento, materia de gran expectativa y trascendencia para el futuro de la medicina. Las células embrionarias e indiferenciadas pueden, con estímulos apropiados, diferenciarse en tejidos específicos. La Fig. 28 (modificada de Pedersen,17) muestra las razones de esa expectativa. En la medida en qué, como se viene haciendo, se van reconociendo los factores que determinan la diferenciación específica, estaremos en condiciones de producir células y tejidos para reemplazo de células y tejidos enfermos. Por eso es que hoy se habla de "ingeniería de tejidos y órganos" y se señalan fechas, en los próximos años, en las que se podrá disponer de tejidos de reemplazo para corregir condiciones, hoy intratables, sin los inconvenientes de las reacciones inmunológicas y los problemas del rechazo tisular. Los bancos de tejidos y órganos serán una realidad en las primeras décadas de este milenio. Pensemos, tan sólo, en un sujeto enfermo que tiene, por ejemplo, un infarto masivo del corazón. Sólo un tercio de su corazón trabaja y el veredicto es unos pocos días de vida. Decide someterse a la experimentación y de él se extrae una célula, por ejemplo de la piel, y con ella procedemos al experimento de transferencia nuclear inicialmente citado. Esto es de la célula obtenida del enfermo se extrae el núcleo y este se inyecta en un óvulo humano donado vacío; se estimula el óvulo a multiplicarse, por las técnicas que hemos visto, y luego de unos días se le hace crecer "in vitro" para formar un cultivo de lo que hemos llamado "células troncales embrionarias humanas". Le añadimos a ese cultivo de células embrionarias del sujeto enfermo los factores que permiten la diferenciación de esas células embrionarias en células musculares cardiacas y en unos pocos días estaremos en condiciones de suministrarle al paciente células musculares cardiacas con su propio genotipo y, por ende, sin ninguna reacción de rechazo, reparar su miocardio dañado.
No se requiere mucha imaginación para extender esta misma idea a otras iguales o más dramáticas situaciones.
La Fig.
29 muestra un listado publicado por Science en febrero del 2000 señalando
las compañías privadas que se han constituido en los EEUU,
Londres y Australia para promover la
No cabe duda que este tema está adquiriendo creciente actualidad e importancia (21-23). El problema ético Siendo todo lo dicho válido, actualmente, continúa el conflicto entre los moralistas que se niegan a aceptar todo lo que signifique manipular células embrionarias humanas y los puristas científicos que consideran que ninguna investigación debe detenerse, y menos aún cuando está dirigida a beneficiar a la especie humana (24, 25). Profesores como el doctor Pedersen de la Universidad de California piensan que al utilizar células cultivadas de la "masa celular interna" del embrión se obvia el problema ético. Personalmente considero este argumento cuestionable porque aunque uno trabaje con cultivos de células embrionarias humanas remitidos de otros laboratorios (lo que ya están haciendo muchos investigadores), el asunto central es que esa "masa celular interna" proviene de un embrión íntegro que sí es potencialmente un ser humano (26).
Quizás la
solución final a este crucial dilema pueda derivarse de las muy
recientes investigaciones de la doctora M. Goodell y colaboradores del
Center for Cell & Gene Therapy, Baylor College of Medicine, quienes
aplicando los avances tecnológicos para cultivos de células
han informado haber desarrollado, a partir de células y tejidos
adultos humanos, cultivos de células con las características,
propiedades y potencial de diferenciación de las llamadas "células
embrionarias troncales humanas" (27, 28). Bibliografía 1. Biological Science.
Brace and Word Inc. Hantcourt. (2nd Ed.). 1968. (*)
Presentado en las Conferencias Magistrales de la Academia Nacional de
Mdicina". Chiclayo, Junio 30 - Julio 1, 2000. |
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