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Identificación
de Bartonella sp mediante reacción
Dr.
Erick Huarcaya (*)(**) Resumen En el Perú la Angiomatosis Bacillar (AB) y la Enfermedad de Arañazo del Gato (EAG) han sido reportados, confirmando el diagnóstico en laboratorios de investigación o del extranjero, no contándose con métodos de rápido diagnóstico. Se captaron 23 pacientes y se estudiaron 8 muestras de tejidos con sospecha de EAG, AB o Verruga Peruana (VP). Se realizaron cultivos en condiciones requeridas. Extracción de DNA de sangre, cultivos y tejido mediante buffers de digestión fueron estandarizados para cada caso. Se amplificó el DNA con primers 16S-ITRFf y 23S-ITRr ó CS-ITRf y CS-ITRr; en gel de agarosa 1%, y cuantificados con DNA / Hind III. Cultivos controles mostraron banda en B. bacilliformis de 948 pb, B. quintana 1310 pb, B. henselae 1427 pb. M. tuberculosus 563 pb. Un paciente con diagnóstico confirmado de EAG por B. henselae, mostró banda concordante con control de B. henselae utilizando los primers 16S y 23S. Una muestra de VP mostró banda concordante con control de B. bacilliformis. Una muestra confirmada por patología de AB mostró bandas concordantes a B. henselae utilizando el primer CS. Se confirmaron casos de EAG, AB y VP en base a muestras de aspirados de ganglio o biopsia mediante PCR. El PCR permitió el diagnóstico diferencial de adenomagalias por EAG y Micobacterias, y de AB en la Verruga Peruana.
Summary In Peru, Bacillary Angiomatosis (BA) and Cat Scratch Disease (CSD) have been reported, and they were confirmed in research or foreign laboratories, although no quickly diagnostic method is available. 23 patients and 8 tissue samples were examined with BA, CSD or Peruvian Wart (PW) suspicious. Cultures were developed under required conditions. DNA extraction from blood, cultures and tissues were standardized using particular digesting buffers on each cases. DNA were amplified using either 16S-ITRFf and 23S-ITRr or CS-ITRf and CS-ITRr primers; amplified products were evident in 1% agarosa gel, and quantified with DNA /Hind III. In control cultures B. bacilliformis showed 948 bp, B. quintana 1310 bp, B. henselae 1427 bp, and M. tuberculosus 563 bp. One patient with serology confirmation of CSD showed 863 bp B. henselae, using 16S and 23S primers. A PW biopsy showed a concordance band with the B. bacilliformis control. One case of BA confirmed by pathology showed B. henselae diagnostic using CS primer. CSD and BA cases were confirmed in base of PCR using tissue samples. PCR allow the discrimination with Mycobacterium sp. adenopathy in the differential diagnostic of CSD, and between BA and Peruvian Wart. Key words: Bartonellosis, PCR, Cat Scratch Disease, Bacillary Angiomatosis.
Introducción En 1996 se realizó en el Perú el primer diagnóstico patológico de un caso de Angiomatosis Bacilar (AB) (1), y en 1999 se describió el diagnostico patológico de trece pacientes de Enfermedad por Arañazo de Gato (EAG) en un estudio retrospectivo (2). En el 2000, un estudio prospectivo (3) identificó B. henselae y B. clarridgeiae en pacientes con EAG y B. henselae en pacientes con AB mediante serología desarrollada en el extranjero, evidenciando la necesidad de contar en el país con métodos de diagnóstico serológicos o moleculares debido a las dificultades que presenta el diagnóstico microbiológico y anatomopatológico. La estandarización de los los procedi-mientos de PCR permitirían utilizar este procedimiento como herramienta diagnóstica en clínica e investigación.
Material y métodos Población de estudio Se recopilaron muestras de aspirado y biopsias de ganglio en el Hospital Nacional Cayetano Heredia, con diagnóstico presuntivo de EAG, AB o Verruga Peruana (VP). La inclusión de pacientes, entre agosto de 2000 hasta agosto de 2001, se realizó sobre la base de los siguientes criterios de inclusión: i). Linfadenomegalia regional en ausencia de otra causa, ii) Individuos con lesiones semejantes a Sarcoma de Kaposi VP o AB. Los criterios de inclusión y definiciones fueron validados previamente (3). PCR: Los procedimientos se realizaron en el laboratorio de Microbiología Experimental del Instituto de Medicina Tropical "Alexander von Humboldt" de la Universidad Peruana Cayetano Heredia. Los cultivos controles fueron obtenidos y preservados conforme a metodología previamente publicada (3). Se siguieron los siguientes protocolos: a) Extracción de ADN de sangre o cultivos: La extracción de DNA a partir de cultivos se realizará usando lisis térmica (4,5), y siguiendo procedimientos descritos a partir de sangre (4). Se resuspendieron las muestras en 20 a 40 µl de agua PCR. b) Extracción de ADN a partir de aspirados o tejido: 50 µl tejido aspirado o tejido homogenizado fueron incubados en 1.5ml de Buffer Digestión (500mM Tris [ph9], 2OmM EDTA, lOmM NaCl, 1% SDS 10%, 0.5 mg/ml proteinaza K) por 24 horas a 60°C, mezcla volumen a volumen dos veces con TE-Fenol Buferado (volumen inicial de 200 µl de muestra) con posterior agitación por 5 min. y centrifugado por 3 min. a l2000 rpm; se realizó precipitación con 300 µl de Etanol absoluto helado dejando en reposo 20 min. a -20°C y centrifugación posterior por 15 min. a l2000 rpm, se añadió 400 µl Etanol 70% agitando por 2 min. y centrifugando 15 min. a l2000rpm; se dejó a temperatura ambiente y se resuspendió con 20 a 40 µl de agua PCR. c) Extracción de ADN a partir de biopsias en parafina: 3 a 6 cortes de una muestra, se desparafinó con 3 series de lavados en Xilol y alcohol, se resuspendió en 0.4 mL de Buffer de Digestión (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HC1 [pH 8.0], 25 mM EDTA [pH 8.0], 0.5% SDS, 100 µg de Proteinaza K) incubando a 60°C durante la noche. Se mezcló 200 µl con Fenol Buffer Saturado (vol.1:1), agitando por 3 min. y en vortex por 30 seg., se centrifugó a 12000 rpm por 5 min., se transfirió el sobrenadante agregando Fenol/clorlformo/isoamyl (vol.1:1), repitiendo el procedimiento y centrifugación, se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Se precipitó mediante 2.5 vol, de Etanol absoluto a -20°C, se agitó un min. y se dejó reposar a -20°C durante la noche; se centrifugó a 12000 rpm por 15 minutos, descartar sobrenadante, secar a 55°C por 15 minutos; se resuspendió en 20 a 40 µl de agua PCR o TE. d) Amplificación: se amplificará regiones codificadas en los segmentos ribosomales 16S y 23S ó de la enzima Citrato Sintetasa (CS) de cada muestra de DNA, utilizando los primers 16S-ITRf l mol/ul (5'-GGC-CTT-GTA-CAC-ACC-G-3) y 23S-ITRr l mol/ul (5'-GGG-TTT-CCC-GATO-TCG-G-3') ó CS-ITRr lmol/ul 10XPCR(1X), dNTP (0.2mM), MgC12 (0.5mM), ADN Taq polymerasa (1.5U). En termociclador presentó un ciclo inicial de 5 min. a 95°C, 35 ciclos de 1 min. a 94ºC- 1 min. a 72 ºC- l min. 72 ºC, y finalmente 1 ciclo de 5 min. a 72 ºC (5,6). e) Electroforesis y cuantificación de pares de bases: productos de amplificación fueron corridos en gel de agarosa 1%, a 80v y 110mAmp. Se realizó la cuantificación con DNA (/Hind III (600ng) y ladder de 100 pares de bases (pb) (6). Se tomaron como controles los cultivos remitidos desde la Universidad de Bristol-Reino Unido, y cultivos de B. bacilliformis y M. tuberculosus del cepario del IMT Alexander von Humboldt.
Resultados Ocho muestras de tejidos fueron analizadas. Una muestra de pus obtenida por aspirado de ganglio con confirmación por IFI (dilución 1/200) de EAG presentó bandas concordantes con B. henselae, así como una muestra de Verruga Peruana con su control de B. bacilliformis (Foto 2). En una muestra de biopsias en parafina de un paciente seropositivo al VIH con AB y Peliosis Hepática confirmados patológicamente con tinción de Wharting-Starring, se obtuvieron bandas concordantes con B. henselae utilizando el primer CS.
Discusión Aproximadamente 40000 casos/año de EAG son reportados en USA,
y es causa de más de 2000 hospitali- zaciones anuales aproximadamente.
Se considera que la EAG afecta principalmente a niños y adultos
jóvenes con un pico de incidencia entre 2 a 14 años (7,8).
AB por otra parte, constituye una enfermedad emergente que ha cobrado
importancia como causa de morbilidad en pacientes con el VIH (8), sin
embargo puede hallarse AB y Peliosis Hepática en individuos
inmuno- competentes (9). En el Perú, actualmente no se cuenta con centros que realicen métodos diagnósticos como serología y/o test cutáneo para las diferentes especies de Bartonellas, y que constituyen criterios diagnósticos (7), por los que la implementación para el diagnóstico de EAG y AB por métodos de biología molecular consideramos que facilitará el mejor conocimiento de estas enfermedades y su diagnóstico en nuestro medio. Estudios adicionales serán requeridos para determinar la sensibilidad y especificidad de la prueba de PCR en las patologías estudiadas.
Bibliografía 1. Arias-Stella, J; Bravo-Puccio, F; Arias-Stella,
C. Angiomatosis Bacilar en el Perú: Una nueva forma de Bartonelosis
que es necesario diferenciar de la Verruga Peruana. FOL DERMAT PER
1996;7:31-36.
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